ஃப்ளோரசன்ஸ் நுண்ணோக்கியில் ஃப்ளோரசன் ஃபில்டர் இன்றியமையாத அங்கமாகும். ஒரு பொதுவான அமைப்பில் மூன்று அடிப்படை வடிப்பான்கள் உள்ளன: ஒரு தூண்டுதல் வடிகட்டி, ஒரு உமிழ்வு வடிகட்டி மற்றும் ஒரு டைக்ரோயிக் கண்ணாடி. அவை பொதுவாக ஒரு கனசதுரத்தில் தொகுக்கப்படுகின்றன, இதனால் குழு நுண்ணோக்கியில் ஒன்றாகச் செருகப்படுகிறது.
ஃப்ளோரசன்ஸ் வடிகட்டி எப்படி வேலை செய்கிறது?
தூண்டுதல் வடிகட்டி
தூண்டுதல் வடிகட்டிகள் ஒரு குறிப்பிட்ட அலைநீளத்தின் ஒளியைக் கடத்துகின்றன மற்றும் பிற அலைநீளங்களைத் தடுக்கின்றன. ஒரு வண்ணத்தை மட்டுமே அனுமதிக்கும் வகையில் வடிகட்டியை டியூன் செய்வதன் மூலம் வெவ்வேறு வண்ணங்களை உருவாக்க அவற்றைப் பயன்படுத்தலாம். தூண்டுதல் வடிப்பான்கள் இரண்டு முக்கிய வகைகளில் வருகின்றன - லாங் பாஸ் ஃபில்டர்கள் மற்றும் பேண்ட் பாஸ் ஃபில்டர்கள். எக்ஸைட்டர் என்பது பொதுவாக ஒரு பேண்ட்பாஸ் வடிப்பானாகும், இது ஃப்ளோரோஃபோரால் உறிஞ்சப்பட்ட அலைநீளங்களை மட்டுமே கடந்து செல்கிறது, இதனால் ஃப்ளோரசன்ஸின் பிற ஆதாரங்களின் தூண்டுதலைக் குறைக்கிறது மற்றும் ஃப்ளோரசன்ஸ் எமிஷன் பேண்டில் தூண்டுதல் ஒளியைத் தடுக்கிறது. படத்தில் நீலக் கோட்டில் காட்டப்பட்டுள்ளபடி, BP 460-495 ஆகும், அதாவது 460-495nm ஒளிரும் தன்மையை மட்டுமே கடக்க முடியும்.
இது ஒரு ஒளிரும் நுண்ணோக்கியின் வெளிச்சப் பாதையில் வைக்கப்பட்டு, ஃப்ளோரோஃபோர் தூண்டுதல் வரம்பைத் தவிர ஒளி மூலத்தின் அனைத்து அலைநீளங்களையும் வடிகட்டுகிறது. வடிகட்டி குறைந்தபட்ச பரிமாற்றம் படங்களின் பிரகாசம் மற்றும் புத்திசாலித்தனத்தை ஆணையிடுகிறது. எந்தவொரு தூண்டுதல் வடிப்பான்களுக்கும் குறைந்தபட்சம் 40% பரிமாற்றம் பரிந்துரைக்கப்படுகிறது, அதாவது பரிமாற்றம் சிறந்ததாக > 85% ஆகும். தூண்டுதல் வடிகட்டியின் அலைவரிசையானது ஃப்ளோரோஃபோர் தூண்டுதல் வரம்பிற்குள் இருக்க வேண்டும், அதாவது வடிகட்டியின் மைய அலைநீளம் (CWL) ஃப்ளோரோஃபோரின் உச்ச தூண்டுதல் அலைநீளத்திற்கு முடிந்தவரை நெருக்கமாக இருக்கும். தூண்டுதல் வடிகட்டி ஆப்டிகல் அடர்த்தி (OD) பின்னணி படத்தின் இருளைக் கட்டளையிடுகிறது; OD என்பது டிரான்ஸ்மிஷன் வரம்பு அல்லது அலைவரிசைக்கு வெளியே அலைநீளங்களை வடிகட்டி எவ்வளவு நன்றாகத் தடுக்கிறது என்பதற்கான அளவீடு ஆகும். குறைந்தபட்ச OD 3.0 பரிந்துரைக்கப்படுகிறது, ஆனால் 6.0 அல்லது அதற்கு மேற்பட்ட OD சிறந்தது.
உமிழ்வு வடிகட்டி
உமிழ்வு வடிப்பான்கள் மாதிரியிலிருந்து விரும்பத்தக்க ஒளிரும் தன்மையை கண்டறிபவரை அடைய அனுமதிக்கும் நோக்கத்திற்காக சேவை செய்கின்றன. அவை குறுகிய அலைநீளங்களைத் தடுக்கின்றன மற்றும் நீண்ட அலைநீளங்களுக்கு அதிக பரிமாற்றத்தைக் கொண்டுள்ளன. வடிப்பான் வகை எண்ணுடன் தொடர்புடையது, எ.கா. BA510IF படத்தில் (குறுக்கீடு தடை வடிகட்டி), அந்த பதவி அதன் அதிகபட்ச பரிமாற்றத்தின் 50% அலைநீளத்தைக் குறிக்கிறது.
தூண்டுதல் வடிப்பான்களுக்கான அதே பரிந்துரைகள் உமிழ்வு வடிகட்டிகளுக்கும் பொருந்தும்: குறைந்தபட்ச பரிமாற்றம், அலைவரிசை, OD மற்றும் CWL. சிறந்த CWL, குறைந்தபட்ச டிரான்ஸ்மிஷன் மற்றும் OD கலவையுடன் கூடிய உமிழ்வு வடிகட்டி, சாத்தியமான ஆழமான தடுப்புடன் கூடிய பிரகாசமான சாத்தியமான படங்களை வழங்குகிறது, மேலும் மங்கலான உமிழ்வு சமிக்ஞைகளைக் கண்டறிவதை உறுதி செய்கிறது.
டைக்ரோயிக் மிரர்
டைக்ரோயிக் கண்ணாடியானது தூண்டுதல் வடிகட்டி மற்றும் உமிழ்வு வடிகட்டிக்கு இடையில் 45° கோணத்தில் வைக்கப்பட்டு, உமிழ்வு சமிக்ஞையை கண்டறிபவரை நோக்கி கடத்தும் போது ஃப்ளோரோஃபோரை நோக்கி தூண்டுதல் சமிக்ஞையை பிரதிபலிக்கிறது. ஐடியல் டைக்ரோயிக் ஃபில்டர்கள் மற்றும் பீம் ஸ்ப்ளிட்டர்கள் அதிகபட்ச பிரதிபலிப்பு மற்றும் அதிகபட்ச பரிமாற்றத்திற்கு இடையே கூர்மையான மாற்றங்களைக் கொண்டுள்ளன, தூண்டுதல் வடிகட்டியின் அலைவரிசைக்கான > 95% பிரதிபலிப்பு மற்றும் உமிழ்வு வடிகட்டியின் அலைவரிசைக்கு > 90% பரிமாற்றம். ஃப்ளோரோஃபோரின் குறுக்குவெட்டு அலைநீளத்தை (λ) மனதில் கொண்டு வடிப்பானைத் தேர்ந்தெடுக்கவும், தவறான-ஒளியைக் குறைக்கவும், ஃப்ளோரசன்ட் பட சமிக்ஞை-க்கு-இரைச்சல் விகிதத்தை அதிகரிக்கவும்.
இந்த படத்தில் உள்ள இருகுறை கண்ணாடி DM505 ஆகும், ஏனெனில் இந்த கண்ணாடியின் அதிகபட்ச பரிமாற்றத்தில் 50% அலைநீளம் 505 நானோமீட்டர்கள் ஆகும். இந்த கண்ணாடியின் டிரான்ஸ்மிஷன் வளைவு 505 nm க்கு மேல் அதிக பரிமாற்றம், 505 நானோமீட்டர்கள் இடதுபுறம் பரிமாற்றத்தில் செங்குத்தான வீழ்ச்சி மற்றும் 505 நானோமீட்டர்களுக்கு இடதுபுறத்தில் அதிகபட்ச பிரதிபலிப்புத்தன்மையைக் காட்டுகிறது, ஆனால் இன்னும் 505 nm க்கும் குறைவான பரிமாற்றத்தைக் கொண்டிருக்கலாம்
லாங் பாஸ் மற்றும் பேண்ட் பாஸ் ஃபில்டர்களுக்கு என்ன வித்தியாசம்?
ஃப்ளோரசன்ஸ் ஃபில்டர்களை இரண்டு வகைகளாகப் பிரிக்கலாம்: லாங் பாஸ் (எல்பி) மற்றும் பேண்ட் பாஸ் (பிபி).
லாங் பாஸ் வடிப்பான்கள் நீண்ட அலைநீளங்களைக் கடத்துகின்றன மற்றும் குறுகியவற்றைத் தடுக்கின்றன. கட்-ஆன் அலைநீளம் என்பது உச்ச பரிமாற்றத்தின் 50% மதிப்பாகும், மேலும் கட்-ஆனுக்கு மேலே உள்ள அனைத்து அலைநீளங்களும் லாங் பாஸ் ஃபில்டர்களால் கடத்தப்படுகின்றன. அவை அடிக்கடி இருக்ரோயிக் கண்ணாடிகள் மற்றும் உமிழ்வு வடிகட்டிகளில் பயன்படுத்தப்படுகின்றன. பயன்பாட்டிற்கு அதிகபட்ச உமிழ்வு சேகரிப்பு தேவைப்படும்போது மற்றும் ஸ்பெக்ட்ரல் பாகுபாடு விரும்பத்தக்கதாகவோ அல்லது அவசியமாகவோ இல்லாதபோது லாங்பாஸ் வடிப்பான்கள் பயன்படுத்தப்பட வேண்டும், இது பொதுவாக குறைந்த அளவிலான பின்னணி ஆட்டோஃப்ளோரசன்ஸைக் கொண்ட மாதிரிகளில் ஒற்றை உமிழும் இனங்களை உருவாக்கும் ஆய்வுகளுக்கு பொருந்தும்.
பேண்ட் பாஸ் வடிப்பான்கள் ஒரு குறிப்பிட்ட அலைநீளப் பட்டையை மட்டுமே கடத்துகின்றன, மேலும் மற்றவற்றைத் தடுக்கின்றன. ஃப்ளோரோஃபோர் எமிஷன் ஸ்பெக்ட்ரமின் வலிமையான பகுதியை மட்டுமே கடத்த அனுமதிப்பதன் மூலம் அவை க்ரோஸ்டாக்கைக் குறைக்கின்றன, ஆட்டோஃப்ளோரசன்ஸ் இரைச்சலைக் குறைக்கின்றன, இதனால் லாங் பாஸ் ஃபில்டர்கள் வழங்க முடியாத உயர் பின்னணி ஆட்டோஃப்ளோரசன்ஸ் மாதிரிகளில் சிக்னல்-டு-இரைச்சல் விகிதத்தை மேம்படுத்துகின்றன.
பெஸ்ட்ஸ்கோப் எத்தனை வகையான ஃப்ளோரசன்ஸ் ஃபில்டர் செட்களை வழங்க முடியும்?
சில பொதுவான வகை வடிப்பான்களில் நீலம், பச்சை மற்றும் புற ஊதா வடிகட்டிகள் அடங்கும். அட்டவணையில் காட்டப்பட்டுள்ளபடி.
| வடிகட்டி தொகுப்பு | தூண்டுதல் வடிகட்டி | டைக்ரோயிக் மிரர் | தடை வடிகட்டி | LED விளக்கு அலை நீளம் | விண்ணப்பம் |
| B | பிபி460-495 | DM505 | BA510 | 485nm | ·FITC: ஃப்ளோரசன்ட் ஆன்டிபாடி முறை ·அசிடின் ஆரஞ்சு: டிஎன்ஏ, ஆர்என்ஏ ·ஆரமைன்: டியூபர்கிள் பேசிலஸ் ·EGFP, S657, RSGFP |
| G | பிபி510-550 | DM570 | BA575 | 535nm | ரோடமைன், டிஆர்ஐடிசி: ஃப்ளோரசன்ட் ஆன்டிபாடி முறை ·ப்ரோபிடியம் அயோடைடு: டிஎன்ஏ ·RFP |
| U | பிபி330-385 | DM410 | BA420 | 365nm | · ஆட்டோ-ஃப்ளோரசன்ஸ் கவனிப்பு ·டிஏபிஐ: டிஎன்ஏ கறை படிதல் ·Hoechest 332528, 33342: குரோமோசோம் கறைக்கு பயன்படுத்தப்படுகிறது |
| V | பிபி400-410 | DM455 | BA460 | 405nm | ·கேடகோலமைன்கள் · 5-ஹைட்ராக்ஸி டிரிப்டமைன் டெட்ராசைக்ளின்: எலும்புக்கூடு, பற்கள் |
| R | பிபி620-650 | DM660 | BA670-750 | 640nm | · Cy5 ·Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647 |
ஃப்ளோரசன்ஸ் கையகப்படுத்தல்களில் பயன்படுத்தப்படும் வடிகட்டி தொகுப்புகள், ஃப்ளோரசன்ஸ் பயன்பாடுகளில் பயன்படுத்தப்படும் முக்கிய அலைநீளங்களைச் சுற்றி வடிவமைக்கப்பட்டுள்ளன, இது அதிகம் பயன்படுத்தப்படும் ஃப்ளோரோஃபோர்களை அடிப்படையாகக் கொண்டது. இந்த காரணத்திற்காக, அவை DAPI (நீலம்), FITC (பச்சை) அல்லது TRITC (சிவப்பு) வடிகட்டி க்யூப்ஸ் போன்ற இமேஜிங்கிற்காக வடிவமைக்கப்பட்ட ஃப்ளோரோஃபோரின் பெயராலும் பெயரிடப்பட்டுள்ளன.
| வடிகட்டி தொகுப்பு | தூண்டுதல் வடிகட்டி | டைக்ரோயிக் மிரர் | தடை வடிகட்டி | LED விளக்கு அலை நீளம் |
| FITC | பிபி460-495 | DM505 | BA510-550 | 485nm |
| DAPI | பிபி360-390 | DM415 | BA435-485 | 365nm |
| TRITC | BP528-553 | DM565 | BA578-633 | 535nm |
| FL-ஆரமைன் | பிபி470 | DM480 | BA485 | 450nm |
| டெக்சாஸ் சிவப்பு | BP540-580 | DM595 | BA600-660 | 560nm |
| mCherry | BP542-582 | DM593 | BA605-675 | 560nm |
ஃப்ளோரசன்ஸ் வடிகட்டியை எவ்வாறு தேர்வு செய்வது?
1. ஃப்ளோரசன்ஸ் ஃபில்டரைத் தேர்ந்தெடுக்கும் கொள்கையானது, ஃப்ளோரசன்ஸ்/உமிழ்வு ஒளியை இமேஜிங் முடிவின் மூலம் முடிந்தவரை கடந்து செல்ல அனுமதிப்பதும், அதே நேரத்தில் தூண்டுதல் ஒளியை முற்றிலுமாகத் தடுப்பதும் ஆகும். குறிப்பாக மல்டிஃபோட்டான் தூண்டுதல் மற்றும் மொத்த உள் பிரதிபலிப்பு நுண்ணோக்கியின் பயன்பாட்டிற்கு, பலவீனமான இரைச்சல் இமேஜிங் விளைவுக்கு பெரும் குறுக்கீட்டை ஏற்படுத்தும், எனவே சத்தம் விகிதத்திற்கு சமிக்ஞைக்கான தேவை அதிகமாக உள்ளது.
2. ஃப்ளோரோஃபோரின் உற்சாகம் மற்றும் உமிழ்வு நிறமாலையை அறிந்து கொள்ளுங்கள். கறுப்புப் பின்னணியுடன் உயர்தர, உயர்-மாறுபட்ட படத்தை உருவாக்கும் ஒளிரும் வடிகட்டி தொகுப்பை உருவாக்க, உற்சாகம் மற்றும் உமிழ்வு வடிகட்டிகள் ஃப்ளோரோஃபோர் தூண்டுதல் உச்சங்கள் அல்லது உமிழ்வுகளுடன் தொடர்புடைய பகுதிகளில் குறைந்தபட்ச பாஸ்பேண்ட் சிற்றலையுடன் அதிக பரிமாற்றத்தை அடைய வேண்டும்.
3. ஃப்ளோரசன்ஸ் ஃபில்டர்களின் ஆயுளைக் கவனியுங்கள். இந்த வடிப்பான்கள் தீவிர ஒளி மூலங்களுக்கு ஊடுருவாமல் இருக்க வேண்டும், இது புற ஊதா (UV) ஒளியை உருவாக்குகிறது, இது "எரிந்துவிடும்", குறிப்பாக எக்ஸைட்டர் வடிப்பானானது வெளிச்ச மூலத்தின் முழுத் தீவிரத்திற்கு உட்பட்டது.
வெவ்வேறு ஃப்ளோரசன்ட் மாதிரி படங்கள்
ஆதாரங்கள் இணையத்தில் சேகரிக்கப்பட்டு ஒழுங்கமைக்கப்படுகின்றன, மேலும் அவை கற்றல் மற்றும் தகவல்தொடர்புக்கு மட்டுமே பயன்படுத்தப்படுகின்றன. ஏதேனும் மீறல் இருந்தால், நீக்க எங்களை தொடர்பு கொள்ளவும்.
இடுகை நேரம்: டிசம்பர்-09-2022